Διαφορετικοί τύποι PCR | Σημαντικά εννοιολογικά MCQ

Διαφορετικοί τύποι PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) | 7 σημαντικά εννοιολογικά MCQ (επιλυμένα)

Περιεχόμενα

Διαφορετικοί τύποι PCR

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) ταξινομείται ευρέως με βάση μικρές τροποποιήσεις στην τυπική διαδικασία PCR. Διαφορετικοί τύποι PCR είναι οι εξής:

Ένθετο PCR

Αυτή η τεχνική προτείνεται να μειώσει τους μολυσματικούς παράγοντες σε ενισχυμένο DNA λόγω της ενίσχυσης τυχαίας δέσμευσης εκκινητή. Η ένθετη PCR εκτελείται με δύο διαφορετικά σύνολα εκκινητών σε δύο διαδοχικούς κύκλους PCR. Το επόμενο σετ αναμένεται να ενισχύσει τον δευτερεύοντα στόχο μέσα στο προϊόν της αρχικής εκτέλεσης. Αυτή η τεχνική είναι εξαιρετικά επιτυχημένη, αν και απαιτεί πολύ περισσότερη γνώση των σχετικών ακολουθιών. 

Αντίστροφη PCR

Εκτελείται όταν είναι γνωστή μόνο μία εσωτερική αλληλουχία προτύπου DNA. Αυτή η τεχνική είναι κατάλληλη για την ταυτοποίηση των πλευρικών αλληλουχιών στα διάφορα ένθετα γονιδίων. Η διαδικασία περιλαμβάνει μια αλληλουχία πέψης και αυτο-απολίνωση του DNA προτύπου, η οποία οδηγεί σε κομμάτια DNA με γνωστές αλληλουχίες στα άκρα μιας άγνωστης αλληλουχίας.

Διαφορετικοί τύποι PCR
(Διαφορετικοί τύποι PCR): Αναπαράσταση της μοριακής δομής της Taq polymerase https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PDB_1ktq_EBI.jpg

Αντίστροφη μεταγραφή PCR (RT-PCR)

Χρησιμοποιείται για την ενίσχυση και τον εντοπισμό γνωστών αλληλουχιών από βιβλιοθήκες RNA. Το RNA που λαμβάνεται από το δείγμα στη συνέχεια μετατρέπεται σε συμπληρωματικό DNA (cDNA) με τη δράση της ενζυμικής αντίστροφης ενζύμου τρανσκριπτάσης. Τυπικό PCR έχει εκτελεστεί μετά. Το RT-PCR χρησιμοποιείται εκτενώς στην ταυτοποίηση και τον προσδιορισμό της γονιδιακής έκφρασης.

Διαφορετικοί τύποι PCR
(Διαφορετικοί τύποι PCR): Το RT-PCR χρησιμοποιεί Fluorophores για να ανιχνεύσει τα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Molecular_Beacons.jpg

Ασύμμετρη PCR

Ενισχύει επιλεκτικά το ένα σκέλος του DNA προτύπου περισσότερο από το άλλο. Χρησιμοποιείται στην ανίχνευση υβριδοποίησης στην οποία μόνο ένας κλώνος θεωρείται ιδανικός. Περαιτέρω ενίσχυση επιτυγχάνεται πραγματοποιώντας τυπική PCR παρουσία περίσσειας εκκινητών για τον επιλεγμένο κλώνο. 

Ποσοτική PCR (Q-PCR)

Αυτή είναι η έμμεση διαδικασία μέτρησης αρχικών ποσοτήτων RNA, cDNA ή DNA προτύπου. Το Q-PCR χρησιμοποιείται γενικά για τον γρήγορο προσδιορισμό της ποσότητας του προϊόντος PCR. Το Q-PCR χρησιμοποιείται επίσης για την ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών εντός του δείγματος DNA.

Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (QRT-PCR ή RTQ-PCR)

Αυτή η διαδικασία χρησιμοποιεί χρωστικές φθορισμού για την παρακολούθηση και τη μέτρηση των ποσοτήτων ενισχυμένων προϊόντων σε πραγματικό χρόνο. Αυτή η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με QPCR.

Touchdown PCR

Αυτή η τεχνική μειώνει τη μη ειδική σύνδεση του εκκινητή μειώνοντας τη θερμοκρασία ανόπτησης μεταξύ δύο διαδοχικών κύκλων PCR.

Αποικία PCR

Οι κλώνοι (π.χ. Ε. Coli) αναλύονται για τα σωστά προϊόντα απολίνωσης. Η συγκεκριμένη αποικία συλλέγεται μέσω αποστειρωμένης οδοντογλυφίδας και εισάγεται στο κύριο μείγμα. Το PCR λειτουργεί με παρατεταμένο χρόνο στα 95oC.

Ειδική αλληλουχία PCR

Αυτή η τεχνική βασίζεται στον μονό νουκλεοτιδικό πολυμορφισμό (SNPs), η ειδική αλληλόμορφη PCR χρησιμοποιείται συχνά για κλωνοποίηση και διαγνωστικούς σκοπούς. Απαιτείται κάποια προηγούμενη γνώση σχετικά με την αλληλουχία DNA των αλληλίων και τη διαφορά τους. Η ειδική αλληλόμορφη PCR περιλαμβάνει τη χρήση εκκινητών SNP που περιέχει 3 'άκρο. Η επιτυχής ενίσχυση αλληλόμορφου PCR και τα ειδικά εναρκτήρια SNP υποδεικνύουν την παρουσία συγκεκριμένου SNP στην αλληλουχία.

Polymerase Cycling Assembly (PCA) ή Assembly PCR

Περιλαμβάνει την τεχνητή παραγωγή των μακρών αλληλουχιών DNA παρουσία μακρών ολιγονουκλεοτιδίων και μικρών επικαλυπτόμενων τμημάτων ακολουθώντας την τυπική διαδικασία PCR. Τα μακρά ολιγονουκλεοτίδια αναστρέφονται και προς τις δύο κατευθύνσεις (νόημα και αντι-νόημα), το επικαλυπτόμενο τμήμα αποφασίζει τη σειρά των θραυσμάτων PCR, διευκολύνοντας την επιλεκτική παραγωγή του τελικού μακρού DNA.

Linear-After-The-Exponential PCR (LATE-PCR)

Σε αυτήν την τεχνική, ο περιοριστικός εκκινητής (το αστάρι που υπάρχει στη χαμηλότερη ποσότητα) έχει υψηλότερο σημείο τήξεως από το περίσσευμα εκκινητή (αστάρι που υπάρχει σε επαρκή ποσότητα) για τη διατήρηση της αποτελεσματικότητας της αντίδρασης καθώς η συγκέντρωση του περιοριστικού εκκινητή μειώνεται στο μέσο της αντίδρασης . 

PCR Dial-Out

Είναι μια μέθοδος ανάκτησης μορίων DNA για τη σύνθεση των γονιδίων. Μια βιβλιοθήκη DNA τροποποιείται με συγκεκριμένες πλευρικές ετικέτες πριν από την αλληλούχιση. Αργότερα, οι εναρκτήρες με ετικέτα επιτρέπουν την ανάκτηση του DNA των επιθυμητών αλληλουχιών με PCR.

Ενίσχυση που εξαρτάται από ελικάση

Έχει σχέση με την παραδοσιακή PCR, αλλά χρησιμοποιεί μια σταθερή θερμοκρασία αντί για ποδηλασία. Η ελικάση DNA χρησιμοποιείται αντί του σταδίου θερμικής μετουσίωσης. 

PCR Hot Start

Αυτή η τεχνική αποκλείει τη δυνατότητα μη ειδικής ενίσχυσης κατά τους αρχικούς κύκλους της PCR. Τα συστατικά της αντίδρασης θερμαίνονται σε θερμοκρασία μετουσίωσης που είναι 95oC πριν από την προσθήκη πολυμεράσης. Αναστολείς και αντισώματα εισάγονται στο μείγμα αντίδρασης για να αναστείλουν τη δραστικότητα ϋΝΑ πολυμεράσης, η οποία διαχωρίζεται σε υψηλές θερμοκρασίες. 

Διαφορετικοί τύποι PCR
(Διαφορετικοί τύποι PCR): Η θερμο-σταθερή πολυμεράση DNA (Taq) καταλύει τη σύνθεση DNA σε εξαιρετικά υψηλές θερμοκρασίες.

Ειδική PCR αλληλουχίας

Αυτή η τροποποίηση της τεχνικής PCR χρησιμοποιείται συχνά για δακτυλικό αποτύπωμα DNA, η οποία απαιτεί την ενίσχυση περιοχών τοποθετημένων μεταξύ των επαναλήψεων απλών αλληλουχιών για τη δημιουργία ενός μοναδικού και ειδικού δακτυλικού αποτυπώματος / μοτίβου ενισχυμένων θραυσμάτων DNA. 

PCR μεσολάβησης απολίνωσης

Χρησιμοποιεί συγκεκριμένα μικρά μόρια συνδέσμου του DNA (που πρόκειται να εισαχθούν) και διάφορους εναρκτήρες ικανούς να συγκολληθούν με το συνδετικό DNA. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται εκτενώς για προσδιορισμό αλληλουχίας DNA και εκτύπωση ποδιών.

Ειδική PCR μεθυλίωσης

Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται για την ανίχνευση νησιών CpG στο γονιδίωμα. Στην ειδική μεθυλίωση PCR, το DNA υποβάλλεται σε επεξεργασία με όξινο θειικό νάτριο, το οποίο μετατρέπει τη μη μεθυλιωμένη βάση κυτοσίνης σε ουρακίλη, η οποία ταυτοποιείται / αναγνωρίζεται από τις βάσεις θυμίνης του εκκινητή PCR. Δύο διαφορετικά σύνολα PCR εκτελούνται στο τροποποιημένο DNA χρησιμοποιώντας πανομοιότυπα σύνολα εκκινητών εκτός από τα νησιά CpG των εκκινητών. Τα σύνολα εκκινητών αναγνωρίζουν τις βάσεις κυτοσίνης και άλλα σύνολα εκκινητών αναγνωρίζουν την ουρακίλη για ενίσχυση του μη μεθυλιωμένου DNA. Το Q-PCR μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί για να γνωρίζει τις ποσοτικές πληροφορίες σχετικά με τη μεθυλίωση. 

Εννοιολογικά MCQ σε διαφορετικούς τύπους PCR (επιλύονται)

Ερώτηση 1: Ένας ερευνητής προσπαθεί να αλλάξει πέντε διαδοχικά ζεύγη βάσεων στη μέση θραυσμάτων DNA ενισχυμένων με PCR. Ποια τεχνική συνιστάται περισσότερο για την εκτέλεση τέτοιων πειραμάτων;

Α- απολίνωση DNA

B- Δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

Μεταλλαξογένεση C- PCR

D- Πεπτική πέψη ενζύμου

Σωστή απάντηση: Επιλογή Γ μεταλλαξογένεση PCR 

Επεξήγηση:

Η πιο συνιστώμενη τεχνική για τέτοιου είδους τροποποιήσεις είναι η μεταλλαξογένεση PCR. Μπορεί να συνθέσει εκκινητές που συνδέονται ατελή στην επιθυμητή θέση της μεταλλαξογένεσης. Αυτοί οι εκκινητές θα περιέχουν τώρα τη νέα ακολουθία ζευγών 5-βάσεων που θα εισαχθεί στο νέο κλώνο DNA. Πρώτον, η PCR θα ενισχύσει το θραύσμα DNA που περιέχει την μεταλλαγμένη αλληλουχία και τις ανοδικές αλληλουχίες. Ο δεύτερος κύκλος της PCR θα ενισχύσει τον νέο κλώνο DNA που περιέχει την μεταλλαγμένη αλληλουχία και επίσης τις ακολουθίες ακολουθίας. Και ο τελικός κύκλος της PCR θα ενισχύσει ένα θραύσμα DNA από τα δύο πρότυπα, χρησιμοποιώντας τους αρχικούς εκκινητές για την ενίσχυση του κλώνου DNA πλήρους μήκους.

Ερώτηση 2: Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιεί θερμοσταθερή πολυμεράση (Taq πολυμεράση) για ενίσχυση του κλώνου DNA. Ποια από τη δήλωση περιγράφει καλύτερα γιατί απαιτούνται θερμο-σταθερές πολυμεράσες για PCR;

Το A- PCR χρειάζεται θερμικό κύκλο και οι πολυμεράσες Taq μπορούν να απενεργοποιηθούν, καθώς δεν είναι απαραίτητες κατά τη διάρκεια των σταδίων χαμηλής θερμοκρασίας. 

Β- Η θερμοσταθερή (Taq) πολυμεράση δεν σπάει το dsDNA εκτός εάν η θερμοκρασία είναι πολύ υψηλή. Επομένως απαιτείται θερμοσταθερή (Taq) πολυμεράση.

Το C- PCR χρειάζεται θερμικό κύκλο και οι θερμοσταθερές (Taq) πολυμεράσες δεν θα μετουσιωθούν για να χάσουν την αποτελεσματικότητα στον πολυμερισμό DNA κατά τη διάρκεια της υψηλής θερμοκρασίας (95oΓ) βήμα. 

D- Η αλληλεπίδραση μεταξύ δισθενών κατιόντων και DNA πολυμεράσης είναι πολύ αποτελεσματική σε στάδια υψηλής θερμοκρασίας. Έτσι, η PCR απαιτεί θερμοσταθερή ϋΝΑ πολυμεράση.

Οι θερμοσταθερές πολυμεράσες (Taq) είναι φθηνότερες από τις τυπικές πολυμεράσες. Έτσι, είναι πιο κατάλληλα για ενίσχυση του DNA. 

Σωστή απάντηση: Επιλογή Γ

Η PCR χρειάζεται θερμικό κύκλο και οι θερμοσταθερές (Taq) πολυμεράσες δεν θα μετουσιώσουν για να χάσουν την αποτελεσματικότητα στον πολυμερισμό DNA κατά τη διάρκεια της υψηλής θερμοκρασίας (95oΓ) βήμα. Αυτό το καθιστά μοναδικό ανάμεσα σε διαφορετικούς τύπους PCR.

Επεξήγηση:

Οι πολυμεράσες μετουσιώνονται συχνά σε υψηλότερες θερμοκρασίες. Εάν χρησιμοποιήθηκε μια τυπική πολυμεράση, θα μετουσιωθεί κατά τη διάρκεια του σταδίου υψηλής θερμοκρασίας (μετουσίωση), το οποίο είναι απαραίτητο για τη διάσπαση του δίκλωνου DNA σε μονόκλωνα πρότυπα DNA. Χρησιμοποιώντας αυτήν την θερμοσταθερή (Taq) πολυμεράση, το ένζυμο δεν θα μετουσιωθεί. Οι κλώνοι DNA θα συνεχίσουν να ενισχύονται με την πολυμεράση Taq που προστέθηκε στην αρχή της PCR.

Ερώτηση 3: Ποια είναι η σωστή σειρά των τριών βημάτων του PCR;

Α- Επέκταση, μετουσίωση, ανόπτηση

B- Μετουσίωση, ανόπτηση, επέκταση 

Γ- Ανόπτηση, επέκταση, μετουσίωση

D- Μετουσίωση, επέκταση, ανόπτηση

Σωστή απάντηση: Επιλογή Β

Μετουσίωση, ανόπτηση, επέκταση 

Επεξήγηση:

Τα βήματα της PCR περιλαμβάνουν μετουσίωση, ανόπτηση και επέκταση.

Η μετουσίωση γίνεται σε θερμοκρασία περίπου 94-98 ° C για να σπάσει τους δεσμούς υδρογόνου του δίκλωνου DNA. 

Η ανόπτηση είναι το δεύτερο βήμα της PCR που ολοκληρώθηκε στους 50-65 ° C. Το στάδιο ανόπτησης πρέπει να πραγματοποιηθεί σε χαμηλή θερμοκρασία για την προσάρτηση των εκκινητών στον μονό κλώνο, αλλά αρκετά υψηλό για να αποφευχθεί μη ειδικός υβριδισμός. 

Το βήμα επέκτασης ή επιμήκυνσης της PCR επιτρέπει στην πολυμεράση DNA να συνθέσει το τελευταίο αντίγραφο του προτύπου DNA κλώνου. Η βέλτιστη θερμοκρασία εξαρτάται από την DNA πολυμεράση που χρησιμοποιείται, αλλά συνήθως κυμαίνεται από 75-80 ° C.

Ερώτηση 4: Ποιο από τα ακόλουθα δεν είναι / δεν αποτελεί συστατικό μείγματος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης;

Α- Ρυθμιστικό διάλυμα

Β- πολυμεράση DNA

C- Φορμαμίδη

Κλώνος προτύπου DNA

Σωστή απάντηση: Επιλογή Γ

Φορμαμίδη

Επεξήγηση:

Τα συστατικά της PCR είναι DNA (Taq) πολυμεράση, ρυθμιστικό διάλυμα, εναρκτήρες, χλωριούχο μαγνήσιο, dNTPs (αδενίνη, γουανίνη, κυτοσίνη, θυμίνη), τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια και ο κλάδος του προτύπου DNA.

συμπεράσματα

Σε αυτό το άρθρο έχουμε συζητήσει διαφορετικούς τύπους PCR. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με αυτό το θέμα επισκεφθείτε διαφορετικοί τύποι PCR.

Για περισσότερα θέματα σχετικά με βιοσύνθεση Βιοτεχνολογίας μπορείτε να επισκεφθείτε τις σελίδες μας.

Σχετικά με τον Δρ. Abdullah Arsalan

Είμαι ο Αμπντουλάχ Αρσλάν, Ολοκλήρωσε το διδακτορικό μου στη Βιοτεχνολογία. Έχω 7 χρόνια ερευνητικής εμπειρίας. Έχω δημοσιεύσει έως τώρα 6 δημοσιεύσεις στα περιοδικά διεθνούς φήμης με μέσο συντελεστή αντίκτυπου 4.5 και λίγα ακόμη είναι υπό εξέταση. Έχω παρουσιάσει ερευνητικές εργασίες σε διάφορα εθνικά και διεθνή συνέδρια. Το αντικείμενο που ενδιαφέρομαι είναι η βιοτεχνολογία και η βιοχημεία με ιδιαίτερη έμφαση στη χημεία πρωτεϊνών, την ενζυμολογία, την ανοσολογία, τις βιοφυσικές τεχνικές και τη μοριακή βιολογία.

Ας συνδεθούμε μέσω του LinkedIn (https://www.linkedin.com/in/abdullah-arsalan-a97a0a88/) ή του μελετητή Google (https://scholar.google.co.in/citations?user=AeZVWO4AAAAJ&hl=el).

Lambda Geeks