Μικροσκοπία φθορισμού | Ορισμός | Εργασία | 3 Σημαντικοί περιορισμοί

Μικροσκοπία φθορισμού

Περιεχόμενα

Τι είναι η μικροσκοπία φθορισμού;

Μικροσκόπια φθορισμού ένας τύπος σύνθετου μικροσκοπίου που λειτουργεί με διάφορες παραλλαγές πηγών φωτός που έχουν διαφορετικά εύρη μήκους κύματος για φθορισμό δείγματος για την παραγωγή εικόνων που αντικαθιστούν τη χρήση μετάδοσης, απορρόφησης, ανάκλασης και σκέδασης. Αυτές οι μικροσκοπικές παραλλαγές χρησιμοποιούνται κυρίως για την παρατήρηση βιολογικών δειγμάτων. Η μικροσκοπία φθορισμού μπορεί να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας τον απλό σχεδιασμό ενός μικροσκοπίου επι-φθορισμού ή ενός σύνθετου εστιακού μικροσκοπίου.

Πώς λειτουργεί η μικροσκοπία φθορισμού;

Το δείγμα διατηρείται πρώτα στο μικροσκοπικό στάδιο. Το δείγμα στη συνέχεια φωτίζεται ανάλογα με την ποσότητα φωτός που απαιτείται. Στη μικροσκοπία φθορισμού, το φως διαφορετικών μηκών κύματος χρησιμοποιείται για να φωτίσει το δείγμα και αυτό το φως στη συνέχεια απορροφάται από το φθοροφόρα παρόν στο δείγμα που εκπέμπει περαιτέρω μια δέσμη φωτός μεγαλύτερου μήκους κύματος ή διαφορετικού χρώματος από εκείνο του εισερχόμενου φωτός. Ένα φίλτρο φασματικής εκπομπής χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό του ασθενέστερου εκπεμπόμενου φωτός από το ισχυρότερο φως. Ένα γενικό μικροσκόπιο φθορισμού έχει τα ακόλουθα μέρη.

  1. Ένα φίλτρο διέγερσης.
  2. Διχρωικός καθρέφτης ή διαχωριστής δέσμης.
  3. Ένα φίλτρο εκπομπών.
  4. Μια πηγή φωτός (που μπορεί να είναι μια λυχνία τόξου ξένου, μια λάμπα ατμού υδραργύρου, LED υψηλής ισχύος ή λέιζερ).
  5. Ένα σύνολο αντικειμενικών φακών.
  6. Ένας οφθαλμικός φακός.
  7. Ένα στάδιο για τη συγκράτηση του δείγματος.
  8. Ένας ανιχνευτής.

Ο διχρωτικός διαχωριστής δέσμης και τα φίλτρα διέγερσης και εκπομπής επιλέγονται έτσι ώστε η φασματική διέγερση να είναι συμβατή με τα χαρακτηριστικά εκπομπής, του φθοροφόρου που χρησιμοποιείται για την επισήμανση δειγμάτων και έτσι ανιχνεύεται η κατανομή ενός χρώματος ή φθοροφόρου εκείνη τη στιγμή . Για την παρατήρηση πολύχρωμων εικόνων πρέπει να συνδυαστούν πολλές μονόχρωμες εικόνες. Ορισμένα μικροσκοπικά σχέδια συνοδεύονται από CCD (συσκευή συζευγμένης φόρτισης) στον σωλήνα μικροσκοπίου στη θέση ενός φακού προσοφθαλμίου. Σε ένα μικροσκόπιο εγκατεστημένο σε CCD, ο σχηματισμός εικόνας εμφανίζεται σε μια οθόνη παρακολούθησης τοποθετώντας το CCD στο ενδιάμεσο επίπεδο εικόνας.

Τι είναι η μικροσκοπία επι-φθορισμού;

Στη μικροσκοπία Epi-φθορισμού η διέγερση του δείγματος με φθορισμό και η ανίχνευση του εκπεμπόμενου φωτός φθορισμού γίνεται ακολουθώντας την ίδια πορεία φωτός, δηλαδή μέσω του αντικειμενικού φακού. Τέτοια μικροσκόπια χρησιμοποιούνται ειδικά για την παρατήρηση ζωντανών δειγμάτων. Για μεγαλύτερη ανάλυση των εικόνων, το αριθμητικό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού έχει αυξηθεί. Ο επι-φθορισμός παράγει υψηλή αναλογία σήματος προς θόρυβο καθώς κάποια ποσότητα ανακλώμενου φωτιστικού φωτός συνδυάζεται με το εκπεμπόμενο φως από το δείγμα. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιείται ο διχρωικός δέκτης. Αυτός ο δέκτης δέσμης ενεργειών ως επιλεκτικό φίλτρο μήκους κύματος και μεταδίδει μόνο το εκπεμπόμενο φως φθορισμού στον προσοφθάλμιο φακό ή στον οφθαλμικό φακό.

Ποια είναι τα μειονεκτήματα της μικροσκοπίας φθορισμού;

  1. Με τον φωτισμό των φθοροφόρων με την πάροδο του χρόνου ως αποτέλεσμα της διαδικασίας φωτολευκαντικής, τα φθοροφόρα μπορεί να χάσουν την ικανότητά τους να φθορίζουν. Η φωτολευκαντική διαδικασία συμβαίνει όταν τα φθορίζοντα μόρια υποφέρουν βαθμιαία από τη χημική βλάβη λόγω της διέγερσης των ηλεκτρονίων κατά τον φθορισμό. Η φωτολευκαντική ικανότητα μπορεί να επηρεάσει σοβαρά τη χρονική περίοδο παρατήρησης ενός δείγματος με μικροσκοπία φθορισμού. 
  2. Η μικροσκοπία φθορισμού επέτρεψε την εξέταση ζωντανών κυττάρων. Ωστόσο, αυτά τα ζωντανά κύτταρα είναι επιρρεπή σε φωτοτοξικότητα (κυρίως με φως μικρού μήκους κύματος) και το φθορίζον μόριο μπορεί να παράγει συγκεκριμένους αντιδραστικούς παράγοντες όταν φωτίζεται, αυτό αυξάνει περαιτέρω το φωτοτοξικό αποτέλεσμα.
  3. Η μικροσκοπία φθορισμού μπορεί να επιτρέψει την απεικόνιση και την παρατήρηση μόνο ορισμένων δομών που έχουν επισημανθεί για φθορισμό. Δηλαδή, ένα δείγμα ιστού θα μπορούσε να παρατηρηθεί με τη βοήθεια μικροσκοπίων φθορισμού εάν τα δείγματα παρουσιάζονται με χρώση φθορισμού DNA. Αυτό μπορεί να δείξει την οργάνωση του DNA εντός των κυττάρων, αλλά δεν μπορεί να αποκαλύψει τίποτα σχετικά με τη μορφολογία των κυττάρων.

Πώς παρασκευάζεται ένα δείγμα φθορισμού;

Γνωρίζουμε ότι, η μικροσκοπία φθορισμού επιτρέπει την απεικόνιση και παρατήρηση μόνο ορισμένων δομών που έχουν επισημανθεί για φθορισμό. Επομένως, το δείγμα που πρέπει να παρατηρηθεί γίνεται φθορίζον με διάφορες τεχνικές όπως:

  1. Βιολογικοί φθορίζοντες λεκέδες: Δημιουργούνται διάφοροι τύποι λεκέδων φθορισμού, που είναι συμβατοί με μια σειρά βιολογικών δειγμάτων. Μερικά παραδείγματα τέτοιων λεκέδων φθορισμού είναι τα DRAQ7 και DRAQ5 (ενθουσιασμένα από το κόκκινο φως), Hoechst και DAPI (ενθουσιασμένος από το φως μήκους κύματος υπεριώδους), φαλλοϊδίνη, Κολλαγόνο υβριδοποιητικό πεπτίδιο, κλπ
  2. Ανοσοφθορισμός: Ο ανοσοφθορισμός χρησιμοποιείται για τη σύνδεση ενός αντισώματος.
  3. Φθορίζουσες πρωτεΐνες: Οι φθορίζουσες πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται για την τροποποίηση του DNA έτσι ώστε τα μόρια να παρουσιάζουν φθορισμό.
Ένα δείγμα του ρέγγα σπέρμα βάφονται με SYBR πράσινο σε ένα γαβάθα φωτίζεται από μπλε φως. πηγή εικόνας: Ζέφυρης - Δική μου δουλειά
CC BY-SA 3.0
Αρχείο: FluorescenceMicroscopeSample HerringSpermSYBRGreen.jpg
Φθορισμός. Πηγή εικόνας: Σβαστιπάνε - Δική μου δουλειά
CC BY-SA 4.0
Αρχείο: Fluorescent dye.jpg

Για να μάθετε περισσότερα σχετικά με το σύνθετο μικροσκόπιο επισκεφθείτε https://lambdageeks.com/compound-microscope-working-5-important-uses/

Σχετικά με το Sanchari Chakraborty

Είμαι πρόθυμος μαθητευόμενος, επί του παρόντος επενδύω στον τομέα της Εφαρμοσμένης Οπτικής και της Φωτονικής. Είμαι επίσης ενεργό μέλος του SPIE (Διεθνής Εταιρεία Οπτικής και Φωτονικής) και του OSI (Optical Society of India). Τα άρθρα μου έχουν ως στόχο να φέρουν στο φως ποιοτικά επιστημονικά ερευνητικά θέματα με απλό αλλά ενημερωτικό τρόπο. Η επιστήμη εξελίσσεται από αμνημονεύτων χρόνων. Γι 'αυτό, προσπαθώ να αξιοποιήσω την εξέλιξη και να το παρουσιάσω στους αναγνώστες.

Ας συνδεθούμε μέσω https://www.linkedin.com/in/sanchari-chakraborty-7b33b416a/

Lambda Geeks