Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης: 9 Σημαντικές Επεξηγήσεις

Περιεχόμενα

Τι είναι η αντίδραση αλυσίδας πολυμεράσης;

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι ένα άλλο ευρέως χρησιμοποιούμενο ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ τεχνική για ενζυματική παραγωγή DNA χωρίς χρήση κυτταρικών μηχανών, για παράδειγμα, ζύμης ή E.coli. Η μέθοδος επιτρέπει μια περιορισμένη ποσότητα του DNA να είναι ενισχυμένο αρκετές πτυχές δραματικά. PCR χρησιμοποιείται τακτικά σε κλινικός, δικανικός, και βιολογικά εργαστήρια για διάφορους σκοπούς, όπως προσδιορισμός γενετικά δακτυλικά αποτυπώματα, διάγνωση ασθένειας, κλωνοποίηση γονιδίων, και  δοκιμή πατρότητας

Αυτή η τεχνική δημιουργήθηκε το 1983 από την Kary Mullis. Η PCR είναι σήμερα μια κρίσιμη και σημαντική διαδικασία που χρησιμοποιείται στην εφαρμοσμένη βιολογία. Αυτά ενσωματώνουν Κλωνοποίηση DNA για προσδιορισμό αλληλουχίας, φυλογενότητα με βάση το DNA ή ενεργή διερεύνηση της γονιδιακής έκφρασης και τον προσδιορισμό γενετικά μεταδιδόμενων ασθενειών Το 1993, ο Mullis έλαβε το βραβείο Νόμπελ Χημείας για το έργο του στο PCR. 

Η PCR γενικά μεταφέρεται σε ένα μείγμα αντίδρασης συνολικού όγκου 0.1-0.2 ml σε σωλήνες αντίδρασης (0.2-0.5 ml όγκοι) σε ένα όργανο γνωστό ως ένας θερμικός κύκλος. Ένας θερμικός κυκλοποιητής θερμαίνει και ψύχει το DNA για να φθάσει στις θερμοκρασίες που απαιτούνται σε κάθε στάδιο της αντίδρασης. Οι σωλήνες αντίδρασης λεπτού τοιχώματος παρέχουν επιθυμητή θερμική αγωγιμότητα επιτρέποντας ταχύτερη θερμική εξισορρόπηση. Συνήθως, οι θερμικοί κύκλοι έχουν θερμαινόμενες κορυφές ή καπάκι που αποτρέπει τη συμπύκνωση των συστατικών της αντίδρασης στην κορυφή του σωλήνα. 

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Εικόνα: Θερμικός κύκλος
https://www.flickr.com/photos/45141485@N04/6358197387/

Απαιτήσεις αντίδρασης αλυσίδας πολυμεράσης

  • DNA θραύσμα προς ενίσχυση (πρότυπο DNA ή cDNA)
  • Αστάρια (εμπρόσθιος εκκινητής και αντίστροφος εκκινητής) ικανός να αναγνωρίζει άκρα του προτύπου DNA. Τα αστάρια έχουν συνήθως 18-25 ζεύγη βάσης.
  • Θερμοσταθερό Πολυμεράση DNA (Taq Πολυμεράση) καταλύει τη σύνθεση DNA. Η πολυμεράση Taq λαμβάνεται από Thermus aquaticus.
  • Τα νουκλεοτίδια
  • Ρυθμιστικό (παρέχει ένα βέλτιστο μέσο για τη δραστηριότητα της θερμοσταθερής πολυμεράσης DNA)
DNA
Σχήμα: Το DNA ενισχύεται μέσω PCR
https://www.flickr.com/photos/hinkelstone/33255693331/

Αρχή λειτουργίας της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Η PCR ονομάζεται αλυσιδωτή αντίδραση επειδή οι πρόσφατα συντεθειμένοι κλώνοι θα δρουν ως πρότυπο για περαιτέρω σύνθεση DNA στους επόμενους κύκλους. 

Η PCR αποτελείται από 3 διαδοχικές αντιδράσεις:

  • Μετουσίωση του DNA: Η διαδικασία της μετουσίωσης διαχωρίζει τους κλώνους του δίκλωνου DNA. Για το ανθρώπινο DNA, το θερμοκρασία μετουσίωσης είναι περίπου 93-95oC. Η μετουσίωση του DNA γίνεται με το σπάσιμο των δεσμών υδρογόνου μεταξύ των δύο πολυνουκλεοτιδικών κλώνων του DNA. Η διαδικασία μετουσίωσης εκτελείται συχνά για 5 λεπτά ή παρατεταμένο χρόνο για να διασφαλιστεί ότι και οι δύο κλώνοι του προτύπου DNA είναι πλήρως διαχωρισμένοι μεταξύ τους. Η διαδικασία μετουσίωσης ενεργοποιεί επίσης τη θερμοσταθερή πολυμεράση DNA.
  • Ανόπτηση Primer: Μετά την μετουσίωση, εισάγονται εμπρός και αντίστροφα αστάρια στο μείγμα αντίδρασης. Το διάλυμα στη συνέχεια ψύχεται για την ανόπτηση του εκκινητή. Συνήθως, η ανόπτηση εναρκτήρα εμφανίζεται μεταξύ 50-70oC ανάλογα με το Tm (θερμοκρασία τήξης) του DNA. Στην ιδανική περίπτωση, η θερμοκρασία ανόπτησης είναι 5oC κάτω από το Tm. Η θερμοκρασία ανόπτησης πρέπει να είναι χαμηλή για να σχηματίσει ένα υβρίδιο μεταξύ του εκκινητή και του DNA του προτύπου και αρκετά υψηλή για να αποτρέψει τα αναντιστοιχία υβριδίων. Το Tm του DNA εξαρτάται αποκλειστικά από το περιεχόμενο GC και AT του DNA. Το στάδιο ανόπτησης αστάρι διαρκεί συνήθως 1-2 λεπτά. Το Tm μπορεί να προσδιοριστεί πειραματικά ή να υπολογιστεί θεωρητικά με τον τύπο που αναφέρεται παρακάτω:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]oC

  • Σύνθεση DNA: Η θερμοσταθερή πολυμεράση DNA (Taq πολυμεράση) δεσμεύεται κοντά στο Περιοχή δέσμευσης RNA και ενσωματώνει τα ελεύθερα νουκλεοτίδια να επιμηκύνει και να συνθέσει έναν νέο κλώνο DNA δίπλα στον κλώνο του εκμαγείου. Η βέλτιστη θερμοκρασία του σταδίου επέκτασης εξαρτάται από τον τύπο της πολυμεράσης που χρησιμοποιείται. για την πολυμεράση Taq, η βέλτιστη θερμοκρασία είναι περίπου 72°CoΓ. Η διάρκεια αυτού του σταδίου επέκτασης εξαρτάται από το μήκος του DNA προτύπου και την αποτελεσματικότητα της θερμοσταθερής πολυμεράσης DNA. Συνήθως, είναι ένα ζεύγος kilobase ανά λεπτό.

Όλες οι αντιδράσεις που αναφέρονται παραπάνω επαναλαμβάνονται 30 φορές για να ληφθούν περίπου 1 δισεκατομμύριο αντίγραφα του DNA του προτύπου.

Η PCR WP ενημερώθηκε 3
Σχήμα: Σχηματική αναπαράσταση της ενίσχυσης DNA από την αντίδραση αλυσίδας πολυμεράσης
https://www.flickr.com/photos/genomegov/26454931973/

Στάδια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Η διαδικασία της PCR χωρίζεται σε τρία στάδια:

  • Εκθετική ενίσχυση: Η πολυμεράση DNA εκτελεί τη βέλτιστη λειτουργία και μετά την ολοκλήρωση κάθε κύκλου, η ποσότητα του προϊόντος διπλασιάζεται. Μόνο λίγη ποσότητα του DNA πρέπει να υπάρχει στο σημείο έναρξης της αντίδρασης, δεδομένου ότι η αντίδραση είναι πολύ ευαίσθητη.
  • Στάδιο ισοπέδωσης: Η DNA πολυμεράση εμφανίζει μικρότερη δραστικότητα λόγω της μικρότερης διαθεσιμότητας των αντιδραστηρίων όπως τα νουκλεοτίδια.
  • Δίσκος - σχάρα: δεν σχηματίζεται πλέον προϊόν λόγω της εξάντλησης του αντιδραστηρίου.

Χρήσεις της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό πολλών ανωμαλιών που συνδέονται με γονιδίωμα, ένα ευρύ φάσμα αναλύσεων και πειραμάτων. Μερικά παραδείγματα της χρήσης PCR συζητούνται παρακάτω:

  • Αναγνώριση μολυσματικών παραγόντων όπως CMV, Mycoplasma, Pneumonia, μεταδοτικές και σχετιζόμενες με πρωτόζωα ασθένειες, ηπατίτιδα κ.λπ. στο δείγμα.
  • Προσδιορισμός κακοήθειας, ειδικά στην περίπτωση λεμφώματος και λευχαιμίας. 
  • Δοκιμή πατρότητας και γενετική αποτύπωση. 

Η PCR επιτρέπει την έγκαιρη αναγνώριση ανωμαλιών που είναι σήμερα η πιο ανεπτυγμένη στην έρευνα για τον καρκίνο. Οι μετρήσεις PCR μπορούν να πραγματοποιηθούν απευθείας στα δείγματα γονιδιωματικού DNA για την αναγνώριση συγκεκριμένων κακοηθών κυττάρων με μετατόπιση με ευαισθησία πάνω από 10,000 φορές σε σύγκριση με οποιαδήποτε άλλη μέθοδο. 

Η PCR αναγνωρίζει επίσης μη καλλιεργήσιμους και αργά αναπτυσσόμενους μικροοργανισμούς, όπως μυκοβακτήρια, αναερόβιους μικροοργανισμούς και ιούς, από τεχνικές καλλιέργειας ιστών και μοντέλα με βάση τα ζώα. Οι επιδεικτικές εφαρμογές PCR στη μικροβιολογία είναι η αναγνώριση των παθογόνων και η ικανότητα διαφοροποίηση μεταξύ μη παθογόνων από παθογόνα στελέχη αναγνωρίζοντας τα συγκεκριμένα γονίδια. 

Το PCR χρησιμοποιείται για να εντείνει ένα μικρό κομμάτι ενός κλώνου DNA. Αυτός ο κλώνος DNA μπορεί να είναι ένα πλήρες γονίδιο ή απλώς ένα μέρος ενός γονιδίου. Σε αντίθεση με τα ζωντανά συστήματα, ο κύκλος PCR μπορεί να ενισχύσει μόνο σύντομα θραύσματα DNA έως 10 ζεύγη kilobase. Διάφορες άλλες τεχνικές μπορούν να ενισχύσουν θραύσματα DNA μεγέθους έως και 40 kb, το οποίο εξακολουθεί να είναι μικρότερο από το μέγεθος του χρωμοσωμικό DNA ενός ευκαρυωτικού κύτταρο - για παράδειγμα, ένα ανθρώπινο κύτταρο περιέχει περίπου τρία δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων νουκλεοτιδίων. 

Πατρικές δοκιμές μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας PCR λαμβάνοντας το DNA των ατόμων που έχουν τη διαφορά. Το DNA των ατόμων της δοκιμής ενισχύεται και χωνεύεται ένζυμα περιορισμού και αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης. Το σχέδιο των θραυσμάτων DNA στο πήκτωμα agrose είναι γνωστό ως το δακτυλικό αποτύπωμα DNA του ατόμου. Άτομα στενά ή συγγενικά με το αίμα θα έχουν παρόμοιο DNA αποτύπωμα μοτίβο σε σύγκριση με τα απομακρυσμένα συγγενικά ή άσχετα άτομα. Τα δακτυλικά αποτυπώματα που λαμβάνονται μπορούν να αναλυθούν περαιτέρω για τον γονέα-παιδί ή τα αδέρφια με δύο ή περισσότερα γενετικά (DNA) δακτυλικά αποτυπώματα. ο Τα δακτυλικά αποτυπώματα DNA που λαμβάνονται μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να γνωρίζουμε τις εξελικτικές σχέσεις μεταξύ των οργανισμών. 

Το μέγεθός του μπορεί εύκολα να αναγνωρίσει το τελικό προϊόν της PCR ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης εκτελείται με έγχυση των δειγμάτων DNA εντός της πηκτής αγαρόζης. Το ηλεκτρικό ρεύμα διέρχεται μέσω της γέλης αγαρόζης για να γνωρίζει την κινητικότητα των δειγμάτων DNA. Μικρότερα θραύσματα DNA κινούνται γρηγορότερα στο πήκτωμα και αντίστροφα. Το προϊόν PCR και το θραύσμα DNA δείγματος ταυτοποιούνται εισάγοντας μια σκάλα DNA στο πήκτωμα αγαρόζης. Η σκάλα DNA περιέχει μόρια DNA γνωστού μεγέθους. 

Προηγουμένως, η αναγνώριση της γενετικής διαταραχής με την παρατήρηση του γονιδιώματος ήταν μια δύσκολη δουλειά. Αργότερα, με την ανάπτυξη της PCR, αυτή η διαδικασία συντομεύεται. Οποιοδήποτε γονίδιο ενδιαφέροντος μπορεί εύκολα να ενισχυθεί χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκκινητές και στη συνέχεια να αλληλουχηθεί για να ανιχνεύσει μεταλλάξεις στο DNA. Η έγκαιρη αναγνώριση ορισμένων θανατηφόρων ιογενών λοιμώξεων μπορεί επίσης να γίνει μέσω PCR. 

δάχτυλο DNA
Σχήμα: Το δακτυλικό αποτύπωμα DNA χρησιμοποιείται για τον πατρικό έλεγχο
https://www.flickr.com/photos/nasamarshall/33350284091/

Τύποι αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Με βάση ορισμένες κατάλληλες τροποποιήσεις στην τεχνική, Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ταξινομείται στους ακόλουθους τύπους:

  • Ένθετο PCR
  • Αντίστροφη PCR
  • Αντίστροφη μεταγραφή (RT-PCR)
  • Ασύμμετρη PCR
  • Ποσοτική (PCR-Q-PCR)
  • Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (QRT-PCR)
  • PCR touchdown
  • Αποικία PCR
  • PCR ειδικά για αλληλόμορφα
  • Συναρμολόγηση PCR ή Polymerase Cycling Assembly (PCA)
  • Ασύμμετρη PCR
  • Γραμμική μετά την εκθετική PCR (LATE-PCR)
  • Αποκλεισμός PCR
  • Ενίσχυση που εξαρτάται από ελικάση
  • Καυτή εκκίνηση PCR
  • PCR ειδικής αλληλουχίας
  • Αντίστροφη PCR
  • PCR μεσολάβησης απολίνωσης
  • Ειδική PCR μεθυλίωσης
  • Μικρή εκκίνηση PCR

Πλεονεκτήματα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

  • Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό μιας ποικιλίας γενετικών ανωμαλιών.
  • Η PCR χρησιμοποιείται σε ένα ευρύ φάσμα εργαστηριακών πειραμάτων και διαδικασιών στη μοριακή βιολογία.
  • Η PCR μπορεί να ανιχνεύσει-Κακοήθειες όπως λευχαιμία, λέμφωμα κ.λπ. και διάφορες άλλες καταστάσεις όπως το Toxoplasma gondi, Staphylococcal βακτηριαιμία, λοιμώξεις από ελονοσία κ.λπ.
  • Το γενετικό αποτύπωμα και ο έλεγχος πατρότητας περιλαμβάνουν το PCR ως το κρίσιμο βήμα τους.
  • Η υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση της PCR το καθιστούν σημαντικό εργαλείο για πειράματα με βάση τη βιοτεχνολογία και τη μοριακή βιολογία.

Μειονεκτήματα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

  • Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης απαιτεί θερμικό κύκλο, ηλεκτροφορητικό συγκρότημα DNA, κιτ απομόνωσης DNA και άλλες δαπανηρές χημικές ουσίες, που καθιστούν τη διαδικασία ακριβή.
  • Απαιτεί εκπαιδευμένους, καταρτισμένους και έμπειρους τεχνικούς για τη διεξαγωγή πειραμάτων.
  • Απαιτούνται εργαστήρια βασικού επιπέδου ασφάλειας με υγραντήρες και εγκαταστάσεις στρωτής ροής.
  • Είναι δύσκολο να προμηθευτείτε δοκιμές που βασίζονται σε PCR για το κοινό.
  • Δεν μπορούσαν να εντοπιστούν και να διαγνωστούν όλες οι ασθένειες μέσω PCR.
  • Δυνατότητα λήψης ψευδώς θετικών και ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη και ευρέως αποδεκτή τεχνική για την ταυτοποίηση αρκετών θανατηφόρων μολυσματικών παραγόντων με ευαισθησία και ειδικότητα. Το PCR χρησιμοποιείται σε διάφορα ιατρικά κέντρα προηγμένων εγκαταστάσεων, σύγχρονα εργαστήρια και ιατρικά ινστιτούτα ως μια ρουτίνα διαγνωστική και ερευνητική ενότητα. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης παίζει καθοριστικό ρόλο στον εντοπισμό ανωμαλιών που αντιπροσωπεύουν άτυπα κλινικά συμπτώματα. Η PCR επιτρέπει την έγκαιρη ανίχνευση αυτών των τύπων βλαβών. Η έγκαιρη ανίχνευση μπορεί να βοηθήσει στη διαχείριση του ατόμου με πολύ καλύτερο τρόπο, γεγονός που μπορεί να μειώσει την κοινωνική και οικονομική επιβάρυνση της οικογένειας του ατόμου.

Για να μάθετε περισσότερα για άλλα θέματα σχετικά με τη Βιοσύνθεση και τη Βιοτεχνολογία κάντε κλικ εδώ

Έλεγχος έννοιας MCQs

Ερώτηση αρ. 1: Ένας μαθητής εκτελεί PCR για να ενισχύσει ένα δείγμα DNA προτύπου. Όμως, ξέχασε να προσθέσει αστάρι DNA στο πείραμα. Ποια από τις παρακάτω επιλογές αντιπροσωπεύει το καλύτερο δυνατό αποτέλεσμα;

Α- Η αντίδραση δεν θα λάβει χώρα.

B- Η αντίδραση θα λειτουργήσει, αλλά η διαδικασία θα ενισχύσει μη ειδικές περιοχές (όχι το επιθυμητό τμήμα DNA του DNA.

C- Η αντίδραση θα λειτουργήσει αλλά με παρατεταμένο ρυθμό

D- Η αντίδραση θα λειτουργήσει και το προϊόν θα εμφανίσει ανεπιθύμητες μεταλλάξεις.

Επιλογή Α: «Η αντίδραση δεν θα λάβει χώρα» είναι η σωστή απάντηση.

Επεξήγηση: Οι εκκινητές είναι απαραίτητοι για τη λειτουργία της PCR. Η πολυμεράση Taq τα χρειάζεται για δέσμευση (στο στάδιο της ανόπτησης) για να ξεκινήσει Αναπαραγωγή DNA. Έτσι η PCR δεν θα λειτουργήσει απουσία εκκινητών και δεν θα λάβει χώρα ενίσχυση.

Ερώτηση αρ. 2: Ένας φοιτητής / ερευνητής θέλει να εισαγάγει το γονίδιο ανθρώπινης αιμοσφαιρίνης σε έναν φορέα έκφρασης για να κλωνοποιήσει και να εκφράσει το γονίδιο σε κύτταρα ποντικού για ανάλυση του φαινοτύπου που προκύπτει. Ποια από τις παρακάτω ακολουθίες διαδικασιών θα επιτρέψει στον μαθητή / ερευνητή να κλωνοποιήσει το γονίδιο με επιτυχία;

Επιλογή Α:

1. Ενισχύστε το γονίδιο μέσω PCR

2. Χρησιμοποιήστε ένα ένζυμο περιορισμού για την κοπή του φορέα έκφρασης

3. Το γονίδιο απολίνωσης και ο χωνευμένος φορέας

Επιλογή Β: 

1. Συνδετικό γονίδιο

2. Χρησιμοποιήστε ένα ένζυμο περιορισμού για την κοπή του φορέα έκφρασης 

3. Ενίσχυση του γονιδίου και του χωνευμένου φορέα έκφρασης μέσω PCR

Επιλογή Γ:

1. Χρησιμοποιήστε ένα ένζυμο περιορισμού για την κοπή του φορέα έκφρασης

2. Ενισχύστε το γονίδιο μέσω PCR

3. Το γονίδιο απολίνωσης και ο χωνευμένος φορέας

Επιλογή Δ:

1. Χρησιμοποιήστε ένα ένζυμο περιορισμού για την κοπή του φορέα έκφρασης

2. Το γονίδιο απολίνωσης και ο χωνευμένος φορέας

3. Ενισχύστε το γονίδιο μέσω PCR

Επιλογή Α: Είναι το διορθώσει επιλογή 

1. Ενισχύστε το γονίδιο μέσω PCR

2. Χρησιμοποιήστε ένα ένζυμο περιορισμού για την κοπή του φορέα έκφρασης

3. Το γονίδιο απολίνωσης και ο χωνευμένος φορέας

Εξήγηση: Πρώτον, θα χρησιμοποιήσουμε PCR για να ενισχύσουμε το γονίδιο που μας ενδιαφέρει από το ανθρώπινο γονιδίωμα που έχει θέσεις περιορισμού στα άκρα (αυτό θα βοηθήσει στην απολίνωση του σε περιορισμό ένζυμο πέψη διάνυσμα). Αργότερα, ο φορέας έκφρασης πρέπει να υποστεί πέψη χρησιμοποιώντας το ίδιο ένζυμο περιορισμού και στη συνέχεια ο χωνευμένος φορέας και το ενισχυμένο γονίδιο απολινώθηκαν μαζί. Το τελικό προϊόν θα αποτελείται από δύο τμήματα: τον αρχικό φορέα και το γονίδιο ενδιαφέροντος.

Ερώτηση αρ. 3: Ποιο όργανο χρησιμοποιείται για την ολοκλήρωση της ενίσχυσης DNA μέσω PCR;

Α- Γενετικός αναλυτής

Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους ακτινοβολίας

C- Θερμοκυκλωτής

D- Φυγοκεντρητής

Επιλογή Γ: Το Thermocycler είναι η σωστή απάντηση

Επεξήγηση: Ο θερμοκυκλοποιητής μπορεί να ρυθμιστεί ώστε να λειτουργεί έναν κύκλο των σταδίων μετουσίωσης, ανόπτησης και επέκτασης, αντίστοιχα, σε μια μικρή ποσότητα του όγκου της αντίδρασης. Ένας θερμικός κύκλος χρησιμοποιείται για την εκτέλεση PCR ενίσχυσης.

Για περισσότερες δημοσιεύσεις σχετικά με το Advance science, παρακαλώ ακολουθήστε αυτή η σύνδεση.

Διαβάστε επίσης: