Αντίστροφη μεταγραφάση | Ο βασικός μηχανισμός του με 10 σημαντικές συχνές ερωτήσεις

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:HIV-1_Reverse_Transcriptase_with_Active_Sites.png

Αντίστροφη μεταγραφάση | Ο βασικός μηχανισμός του με 10 σημαντικές συχνές ερωτήσεις

Περιεχόμενα

Μεταγραφή

Η μεταγραφή είναι η αρχή προς το «Gene Expression».

Σε αυτήν τη διαδικασία, οι πληροφορίες που περιέχονται στον "γενετικό κώδικα τεσσάρων γραμμάτων του DNA" μεταφέρονται στον γενετικό κώδικα τριών γραμμάτων του RNA. "

, μπορούμε να εξηγήσουμε τη μεταγραφή καθώς δημιουργεί ένα αντίγραφο του RNA από το DNA, ή οι γενετικές πληροφορίες μεταφέρονται από το DNA στο RNA.

Η διαδικασία μεταγραφής περιλαμβάνει ένα ένζυμο γνωστό ως πολυμεράση RNA. Αυτό το ένζυμο χρησιμοποιεί το DNA ως μήτρα και διευκολύνει τη σύνδεση των νουκλεοτιδίων για να σχηματίσει RNA (που αντιστοιχεί και συμπληρώνει την αλληλουχία DNA του προτύπου).

Η διαδικασία μεταγραφής ολοκληρώνεται σε τρία στάδια.

Στάδιο 1: Μύηση

Στάδιο 2: Επιμήκυνση

Στάδιο 3: Τερματισμός

Σχήμα: Τρία βασικά στάδια μεταγραφής (διαδικασία μεταφοράς γενετικών πληροφοριών από DNA σε RNA). Έναρξη, επιμήκυνση και τερματισμός https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Eukaryotic_Transcription.png

Σε ευκαρυώτες, μερικά στάδια είναι γνωστά ως μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις συμβαίνουν επίσης στα οποία το RNA υφίσταται τροποποιήσεις όπως:

Συγκόλληση

5'-ανώτατο όριο

Ενσωμάτωση ουράς Poly A

Σημαντική σημείωση: Η μεταγραφή γίνεται για κάθε γονίδιο που υπάρχει στο γονιδίωμά μας ξεχωριστά.

Το DNA έχει τεράστια γονίδια, κάθε γονίδιο κωδικοποιεί ένα γονίδιο. Η μεταγραφή αντιγράφει τις πληροφορίες του γονιδίου που κωδικοποιεί πρωτεΐνη σε ένα αντίγραφο RNA.

Μεταγραφάση

Οι μεταγραφάσες είναι τα ένζυμα που καταλύουν τη σύνθεση RNA από το πρότυπο DNA. αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως μεταγραφή. Οι αντίστροφες τρανσκριπτάσες (RTs) είναι τα ένζυμα που καταλύουν το σχηματισμό cDNA (συμπληρωματικό DNA) από το πρότυπο RNA. Αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως αντίστροφη μεταγραφή.

Αντίστροφη μεταγραφή

Κατά τη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής, το DNA συντίθεται από ένα πρότυπο RNA (αντίθετο από τη διαδικασία μεταγραφής, στην οποία το RNA συντίθεται από το πρότυπο DNA). Το DNA που παράγεται με αντίστροφη μεταγραφή είναι γνωστό ως συμπληρωματικό DNA (cDNA). Η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιείται από ένα ένζυμο γνωστό ως αντίστροφη μεταγραφάση. 

Απαιτήσεις αντίστροφης μεταγραφάσης:

           Πρότυπο RNA

           Κοντό αστάρι (για σύνδεση με το 3 'άκρο του RNA)

Το κοντό αστάρι συνδέεται με τη συμπληρωματική περιοχή στο 3 'άκρο και ξεκινά τη σύνθεση συμπληρωματικού DNA. Αυτό το cDNA χρησιμοποιείται στην PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) ως το πρότυπο DNA. Το cDNA στη συνέχεια μετατρέπεται σε δίκλωνο DNA με DNA πολυμεράση και δράση λιγάσης DNA. Αυτός ο συνδυασμός PCR και RT-PCR (ένας συνδυασμός αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και αντίστροφης μεταγραφής) επιτρέπει την ανίχνευση μικρών ποσοτήτων RNA που υπάρχουν στο δείγμα. Η αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιείται συχνά στην κλωνοποίηση για την αύξηση του αριθμού αντιγράφου. 

Αντίστροφη μεταγραφή
Εικόνα: Σχέδιο αντίστροφης μεταγραφής, το RT συνδέεται με το ssRNA και κατευθύνει τη σύνθεση του cDNA που μετατρέπεται αργότερα σε dsDNA. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction.jpg

Πολλά κατασκευασμένα RT χρησιμοποιούνται συχνά για την αύξηση της αποτελεσματικότητας του σχηματισμού προϊόντων. Το κατασκευασμένο RT διασφαλίζει την πλήρη αντιγραφή του 5 'άκρου του mRNA. Τα θερμοσταθερά RT έχουν επίσης σχεδιαστεί για χρήση σε υψηλότερες θερμοκρασίες.

Τι συνθέτει η αντίστροφη μεταγραφάση;

Η αντίστροφη μεταγραφάση διευκολύνει τη σύνθεση DNA από το ιικό γονιδίωμα RNA. Αυτό το πρόσφατα σχηματισμένο DNA είναι γνωστό ως συμπληρωματικό DNA (cDNA). Το RT υπάρχει κυρίως σε ιούς που περιέχουν RNA γονιδίωμα. Το γονιδίωμα RNA που περιέχει ιό είναι γνωστό ως ρετροϊός.

Ποια είναι η λειτουργία της αντίστροφης μεταγραφάσης;

Η αντίστροφη τρανσκριπτάση είναι μια εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση DNA (απαιτεί RNA ως πρότυπο για τη σύνθεση του cDNA). Το RT αναγνωρίζει και δεσμεύει το RNA για να συνθέσει ένα μονό στάσιμο RNA (ssRNA). Μετά τη σύνθεση του cDNA, το RT διασπά το RNA και αρχίζει να συνθέτει δίκλωνο DNA (dsDNA).   

Η αντίστροφη μεταγραφάση έχει δύο ενεργές τοποθεσίες (ενεργές τοποθεσίες) για την εκτέλεση δύο ξεχωριστών λειτουργιών:

Ενεργός ιστότοπος πολυμεράσης: περιλαμβάνει δύο τομείς τύπου δακτύλου. ένας τομέας μπορεί να ταυτοποιήσει το RNA και σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με φωσφορικές ομάδες χρησιμοποιώντας πλευρικές αλυσίδες.

Ο σχηματισμός δεσμού υδρογόνου επιφέρει αλλαγές διαμόρφωσης και διευκολύνει το κλείσιμο της οπής αναγνώρισης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την έναρξη της διαδικασίας μεταγραφής (με την προσθήκη νουκλεοτιδίων) με τη βοήθεια των ιόντων μαγνησίου δεύτερης περιοχής.

Η ευέλικτη ζώνη διέπει τη διαδικασία αλλαγής διαμόρφωσης. Αυτή η εύκαμπτη ζώνη υπάρχει μεταξύ των πεδίων ενεργών θέσεων πολυμεράσης Συχνά θεωρείται θέση στόχος για την αναστολή της δραστηριότητας RT κατά τη διάρκεια βιοχημικών και φαρμακολογικών μελετών. Η αλληλουχία αμινοξέων που υπάρχει στην εύκαμπτη ζώνη δεν διατηρείται (αλλάζει πολύ κατά τη διάρκεια της εξέλιξης), γεγονός που επιτρέπει στον ιό να αναπτύξει αντίσταση.

Τομέας ριβονουκλεάσης Η: είναι υπεύθυνη για τη διάσπαση της έκδοσης RNA και ssDNA. Το ιόν μαγνησίου βοηθά τον τομέα ριβονουκλεάσης Η στην αναγνώριση φωσφορικών ομάδων. Η δεύτερη αλυσίδα της περιοχής ριβονουκλεάσης Η δεν έχει ενζυματική δράση. Αλληλεπιδρά και σταθεροποιεί μόνο τον ενεργό ιστότοπο.

Η έρευνα συνεχίζεται για τον ακριβή καταλυτικό μηχανισμό της RT. Το προαναφερθέν σχήμα είναι η βασική ιδέα της κατάλυσης που έγινε από την RT.

Σε αντίθεση με την πολυμεράση DNA, το RT στερείται δραστικότητας διόρθωσης λόγω της απουσίας θραύσματος Klenow. Η έλλειψη δραστηριότητας διόρθωσης δοκιμών παράγει περισσότερα σφάλματα στο αντίγραφο, γεγονός που οδηγεί σε τεράστιες πιθανότητες μεταλλάξεων στον ιό.

Αντίστροφη μεταγραφάση ρετροϊού

Τα ιικά σωματίδια όλων των ρετροϊών περιέχουν ένα πολυλειτουργικό ένζυμο γνωστό ως RT. Αυτό το RT απαιτείται για να συνθέσει το αντίγραφο DNA του γονιδιώματος RNA ενός ρετροϊού μόλις εισέλθει σε ένα κύτταρο ξενιστή. 

Ο προσδιορισμός της τρισδιάστατης δομής της αντίστροφης μεταγραφάσης αποκάλυψε τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο ενεργών θέσεων, συμπεριλαμβανομένης της δέσμευσης και της κατάλυσης. Η δομική γνώση του ενζύμου μας δίνει την ευκαιρία να μελετήσουμε νέα αντι-ιικά φάρμακα για θεραπεία ενάντια στους ρετροϊούς.

Αντίστροφη μεταγραφάση HIV

Ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) είναι υπεύθυνος για τη διάδοση του συνδρόμου επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας (AIDS). Ο HIV κωδικοποιεί κυρίως τέσσερις τύπους πρωτεϊνικών υπομονάδων που εμφανίζουν ϋΝΑ πολυμεράση, RNase Η, ιντεγκράση και παρόμοια με πρωτεάση δράση. Η δραστικότητα DNA πολυμεράσης και RNase Η κατέχεται από μία μόνο υπομονάδα ανάστροφης τρανσκριπτάσης HIV (ετεροδιμερικό ένζυμο).

Για να μετατραπεί το γονιδιωματικό RNA του ιού στο dsDNA σε ένα κύτταρο ξενιστή, η αντίστροφη μεταγραφάση HIV εμφανίζει δραστικότητα τόσο της RNase Η όσο και της πολυμεράσης DNA. Η έρευνα συνεχίζεται για να μάθει τον μηχανισμό του τρόπου με τον οποίο η αντίστροφη τρανσκριπτάση HIV αναπτύσσει την υπομονάδα της (τομέας Ριβονουκλεάσης Η) για την υδρόλυση του γονιδιώματος (RNA) του ρετροϊού. Οι θέσεις και η αντίστροφη διαμόρφωση μεταγραφάσης για σύνθεση DNA και υδρόλυση RNA είναι διαφορετικές. Αυτή η διάκριση στη διαμόρφωση και αποκάλυψη της δομικής κοιλότητας την καθιστά πιθανό υποψήφιο στόχο για αναστολή αντίστροφης μεταγραφάσης.

Σχήμα: Δομή της αντίστροφης μεταγραφάσης του HIV κατά τη σύνθεση του cDNA, Συνήθως το HIV RT έχει δύο ενεργές θέσεις. μία καταλυτική θέση έχει λειτουργία πολυμεράσης ενώ άλλη έχει δραστικότητα νουκλεάσης. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcriptase_3KLF_labels.png

Σημαντική σημείωση: Η δραστικότητα RNase H της αντίστροφης μεταγραφάσης HIV εξαρτάται πλήρως από την αλληλουχία αμινοξέων της δραστικής περιοχής. Ο πραγματικός μηχανισμός δεν έχει ακόμη ανακαλυφθεί.

συμπεράσματα

Αυτό το άρθρο συζήτησε τα γεγονότα της μεταγραφής, της αντίστροφης μεταγραφής και τη σημασία της αντίστροφης μεταγραφάσης στους ρετροϊούς. Για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με σχετικά θέματα, Κάνε κλικ εδώ.

FAQs

Q1 Ποιος είναι ο ρόλος της αντίστροφης μεταγραφάσης

Απάντηση: Το ένζυμο RT είναι επίσης γνωστό ως εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση DNA. καταλύει τη μεταγραφή του ρετροϊικού γονιδιωματικού RNA σε cDNA.

Ε2 Από πού προέρχεται η αντίστροφη μεταγραφάση

Απάντηση: Η διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής εμφανίζεται σε ρετροϊούς, προκαρυώτες και ακόμη και σε ευκαρυώτες σε κάποιο βαθμό. Συμμετέχει στη σύνθεση του cDNA από το RNA. Οι ρετροϊοί έχουν RT, οι οποίοι εξαρτώνται από το RNA για τη σύνθεση του cDNA. Η πυρηνική διαίρεση δεν περιλαμβάνει τη χρήση RT. Ένα ένζυμο γνωστό ως τελομεράση υπάρχει στα ευκαρυωτικά. Η τελομεράση είναι ένα εξειδικευμένο RT που συνθέτει τελομερές DNA (που υπάρχει στις άκρες των χρωμοσωμάτων) από το RNA.

Ε3 Ποιοι οργανισμοί έχουν αντίστροφη μεταγραφάση

Απάντηση: Το ένζυμο RT υπάρχει σε πολλούς οργανισμούς όπως φυτά, ζώα, βακτήρια και ιούς. Ο ρόλος του ενζύμου RT είναι να μετατρέψει μια αλληλουχία RNA σε μια αλληλουχία cDNA. Είναι γενικό σε όλους τους οργανισμούς. Οι ειδικές λειτουργίες του RT περιλαμβάνουν:

Διάδοση ρετροϊού

Ποικιλία ευκαρυωτικών κινητών τρανσποζονίων ή ρετροτρανσποζόνων

Αντιγραφή ή σύνθεση τελομερών

Σύνθεση μονόκλωνου DNA πολλαπλών αντιγράφων (msDNA), εξωχρωμοσωμικού DNA / RNA και χιμαιρικών στοιχείων.

Ε4 Οι άνθρωποι κάνουν αντίστροφη μεταγραφάση.

Απάντηση: Ναι, οι άνθρωποι εκφράζουν αντίστροφες μεταγραφάσες. Η τελομεράση είναι ένας τύπος αντίστροφης μεταγραφάσης. Βρίσκεται σε πολλά ευκαρυωτικά. Οι άνθρωποι φέρουν ένα πρότυπο τελομεράσης RNA για να σχηματίσουν τελομερές DNA.

Ε5 Πώς αποτρέπετε την αντίστροφη μεταγραφάση

Απάντηση: Η αντίστροφη δραστηριότητα της τρανσκριπτάσης μπορεί να προληφθεί χρησιμοποιώντας ισχυρούς αναστολείς ενζύμων. Αυτοί οι αναστολείς (ειδικά για RT) είναι γενικά αντι-ρετροϊικοί παράγοντες. Οι αναστολείς περιορίζουν το RT σχηματίζοντας cDNA από ιικό RNA, και ως εκ τούτου σταματά την εξάπλωση του ιού.

Ε6 Ποια είναι η διαφορά μεταξύ PCR πραγματικού χρόνου και αντίστροφης μεταγραφάσης

Απάντηση: Η αντίστροφη μεταγραφάση PCR (RT-PCR) είναι πολύ πιο ευαίσθητη από την κανονική PCR. Το RT-PCR χρησιμοποιείται συχνά για την ανίχνευση της έκφρασης ενός συγκεκριμένου γονιδίου, προσδιορισμό αλληλουχίας DNA, κλωνοποίηση DNA, παρακολούθηση κληρονομικών ασθενειών και ανάλυση λειτουργικών γονιδίων. Αντιθέτως, η γενική PCR χρησιμοποιείται ευρέως για σκοπούς ενίσχυσης DNA.

Ε7 Γιατί το RNA μετατρέπεται σε cDNA

Απάντηση: η αντίστροφη μεταγραφάση συνήθως μεταγράφει το πρότυπο RNA σε cDNA. 

Το cDNA χρησιμοποιείται γενικά στη μοριακή βιολογία για κλωνοποίηση ευκαρυωτικών γονιδίων στα εργοστάσια προκαρυωτικών κυττάρων. Όποτε θέλουμε να εκφράσουμε μια πρωτεΐνη (εξωτερικής πηγής) σε ένα κύτταρο που κανονικά δεν συνθέτει τέτοια πρωτεΐνη, απαιτούμε μετασχηματισμό cDNA στο εργοστάσιο προκαρυωτικών κυττάρων.

Q8 Ποια είναι η διαφορά μεταξύ QPCR και RT-PCR

Απάντηση: Και οι δύο τεχνικές είναι αλληλένδετες και χρησιμοποιούνται για την παραγωγή / ενίσχυση αντιγράφων DNA. Το RT-PCR ενισχύει την αντίστροφη μεταγραφή του κωδικού RNA, ενώ το Q-PCR μετρά τη διαδικασία ενίσχυσης. Το Q-PCR προορίζεται για ποσοτικοποίηση, ενώ το RT-PCR είναι για ενίσχυση. Το Q-PCR είναι ποσοτικό, ενώ το RT-PCR δεν είναι ποσοτικό.

Ε9 Μπορεί η αντίστροφη μεταγραφάση να χρησιμοποιήσει το DNA ως πρότυπο.

Απάντηση: Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιεί μονόκλωνο RNA ως πρότυπο για τη σύνθεση αντιγράφου διπλού κλώνου DNA. Οι RT δεν χρησιμοποιούν το DNA ως πρότυπο.

Ε10 Ποιο είναι το διακριτικό χαρακτηριστικό της αντίστροφης μεταγραφάσης

Απάντηση: Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της αντίστροφης μεταγραφάσης είναι η μεταφορά των γενετικών πληροφοριών από το RNA στο DNA. 

Σχετικά με τον Δρ. Abdullah Arsalan

Είμαι ο Αμπντουλάχ Αρσλάν, Ολοκλήρωσε το διδακτορικό μου στη Βιοτεχνολογία. Έχω 7 χρόνια ερευνητικής εμπειρίας. Έχω δημοσιεύσει έως τώρα 6 δημοσιεύσεις στα περιοδικά διεθνούς φήμης με μέσο συντελεστή αντίκτυπου 4.5 και λίγα ακόμη είναι υπό εξέταση. Έχω παρουσιάσει ερευνητικές εργασίες σε διάφορα εθνικά και διεθνή συνέδρια. Το αντικείμενο που ενδιαφέρομαι είναι η βιοτεχνολογία και η βιοχημεία με ιδιαίτερη έμφαση στη χημεία πρωτεϊνών, την ενζυμολογία, την ανοσολογία, τις βιοφυσικές τεχνικές και τη μοριακή βιολογία.

Ας συνδεθούμε μέσω του LinkedIn (https://www.linkedin.com/in/abdullah-arsalan-a97a0a88/) ή του μελετητή Google (https://scholar.google.co.in/citations?user=AeZVWO4AAAAJ&hl=el).

Lambda Geeks